Replikasi DNA

Replikasi DNA diawali dengan pemutusan ikatan-ikatan hidrogen oleh enzim helikase sehingga kedua rantai DNA akan terpisah. Kedua rantai yang terpisah diikat oleh SSB untuk mencegah terjadinya penggabungan kembali dari kedua rantai. Selanjutnya primase mensistesis oligunukleotida (berupa RNA) yang disebut primer, primer ini menyediakan gugus 3'OH yang dibutuhkan DNA Polimerase untuk memperpanjang rantai DNA. Tahap selanjutnya adalah pemanjangan rantai yg dilakukan oleh DNA Polimerase. Proses pemanjangan ini hanya dapat berlangsung dari arah 5' ke 3', kondisi ini mengakibatkan dihasilkannya dua produk yg berbeda.

DNA yg disintesis searah dg pembukaan rantai double heliks (rantai induk) akan menghasilkan rantai kontinu yang disebut dg leading strand sedangkan DNA yg di sintesis berlawanan arah akan menghasilkan rantai fragmen-fragmen DNA pendek yg disebut fragmen okazaki. Lalu, Fragmen-fragmen DNA akan disatukan menjadi rantai kontinu oleh enzim ligase, hasil dari penyatuan ini adalah berupa rantai kontinu yg disebut lagging strand.

DNA polymerases tidak mampu ‘mengisi’ ikatan covalent yang hilang. Celah yang tersisa direkat oleh DNA ligase. Enzim ini mengkatalis pembentukan ikatan phosphodiester antara 3’ – OH dari salah satu helaian dari 5’-P dari helaian yang lain.DNA ligase diaktifkan oleh AMP (adenosine monophosphate) sebagai ‘cofactor’ (faktor pengendali). Dalam E.coli, AMP dibawa dari nucleotide NAD+. Dalam sel-sel eukaryotik, AMP ditandai dari ATP. Ligase-ligase tidak dilibatkan dalam pemanjangan rantai; melainkan, mereka berperan pemasang enzim-enzim untuk perekatan ‘celah’ melalui molekul DNA.
Setelah DNA direplikasikan, dua helaian tersintesis terbaru dipasangkan ke modifikasi enzimatik. Perubahan-perubahan ini biasanya melibatkan penambahan molekul-molekul tertentu untuk mengkhususkan titik-titik sepanjang helix ganda. Pada cara ini, tags sel, atau label-label, DNA, sehingga ini bisa membedakan material genetiknya sendiri dari berbagai DNA asing yang mungkin bisa masuk ke dalam sel. Modifikasi post-replikasi DNA mungkin juga mempengaruhi cara molekul diikat. DNA merupakan faktor utama modifikasi dengan penambahan kelompok methyl ke beberapa adenine dan residu-residu cytosine. Grup methyl ditambahkan oleh DNA methylasess setelah nucleotides telah digabungkan dengan DNA polymerases.
Penambahan methyl ke cytosine membentuk 5-methylcytosine dan methylasi dari adenine membentuk 6-methyladine. Methyladine lebih umum daripada methylcytosine dalam sel-sel bakterial, di mana dalam sel-sel eukaryotik, grup methyl paling banyak ditambahkan ke cytosine. Methylase muncul hanya pada beberapa rentetan nucleotide khusus. Dalam sel-sel eukaryotik, sebagai contoh, methylasi secara umum muncul pada saat cytosine berdampingan ke guanine di sisi 3’-OH (5’ P-CG-3’OH).Pola methylasi bersifat spesifik untuk spesies yang diberikan, berperan seperti tanda tangan untuk DNA spesies tersebut. Hal ini patut diperhatikan karena grup methy melindungi DNA melawan perlawanan enzim-enzim tertentu disebut ‘restriction endonucleases’ Oleh karena itu DNA asing melalui  sebuah sel dicerna dengan ‘restriction endonucleases’. Dalam sel tertentu, ‘restriction endonucleases’ bisa memotong DNA di titik khusus tertentu di mana DNA methylase menambah sebuah grup methyl.

Teknik Transgenik

Transgenik adalah tanaman yang telah direkayasa bentuk maupun kualitasnya melalui penyisipan gen atau DNA binatang, bakteri, mikroba, atau virus untuk tujuan tertentu. Organisme transgenik adalah organisme yang mendapatkan pindahan gen dari organisme lain. Gen yang ditransfer dapat berasal dari jenis (spesies) lain seperti bakteri, virus, hewan, atau tanaman lain.

Gen yang telah  diidentifikasi, diisolasi dan kemudian dimasukkan ke dalam  sel tanaman.Melalui  suatu sistem tertentu, sel tanaman yang  membawa  gen tersebut dapat dipisahkan dari sel tanaman yang  tidak  membawa gen.  Tanaman  pembawa  gen  ini  kemudian  ditumbuhkan secara normal.  Tanaman inilah yang disebut sebagai tanaman transgenik karena ada  gen  asing  yang  telah dipindahkan dari makhluk  hidup lain ke tanaman tersebut (Muladno, 2002).

Transgenik umumnya diambil dari organisme yang memiliki sifat unggul tertentu.  Misal, pada proses membuat jagung Bt tahan hama, pakar bioteknologi memanfaatkan gen bakteri tanah Bacillus thuringiensis (Bt) penghasil racun yang mematikan bagi hama tertentu.  Gen Bt ini disisipkan ke rangkaian gen tanaman jagung. Sehingga tanaman resipien (jagung) juga mewarisi sifat toksis bagi hama. Ulat atau hama penggerek jagung Bt akan mati (Intisari, 2003).

Perakitan tanaman transgenik berkembang pesat setelah adanya laporan pertama kali tentang perakitan tanaman transgenik pada tahun 1984 (Horsch et al. 1984). Perakitan tanaman transgenic tahan hama merupakan salah satu bidang yang mendapat perhatian besar dalam perbaikan tanaman. Perakitan tanaman transgenik tahan hama umumnya mempergunakan gen dari Bacillus thuringiensis (Bt). Pada tahun 1995, tanaman transgenik pertama mulai tersedia bagi petani di Amerika Serikat, yaitu jagung hibrida yang mengandung gen cry IA(b), Maximizer, yang dibuat oleh Novartis, tanaman kapas yang mengandung gen cry IA(c), Bollgard, dan kentang yang  mengandung gen cry 3A, Newleaf, yang dibuat oleh Monsanto. Pada tahun 1996, luas area pertanaman jagung transgenic hanya 158 ha, namun pada tahun 1997 dan 1998 luas area ini meningkat masingmasing menjadi 1,20−1,60 juta hektar dan 6,70 juta hektar (Matten 1998). Sampai dengan tahun 1998, lebih dari 10 jenis tanaman telah berhasil ditransformasi untuk mendapatkan tanaman transgenic tahan hama. Tanaman tersebut meliputi tembakau, tomat, kentang, kapas, padi, jagung, popular, whitespruce, kacang garden pea, kacang hijau, stroberi, dan kanola (Schuler et al. 1998).

1.2. Proses Transgenik

Cara seleksi sel transforman akan diuraikan lebih rinci pada penjelasan tentang plasmid. Pada dasarnya ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi setelah transformasi dilakukan, yaitu

(1) sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau berarti transformasi gagal.

(2) sel inang dimasuki vektor religasi atau berarti ligasi gagal.

(3) sel inang dimasuki vektor rekombinan dengan/tanpa fragmen sisipan atau gen yang

     diinginkan.

Untuk membedakan antara kemungkinan pertama dan kedua dilihat perubahan sifat yang terjadi pada sel inang. Jika sel inang memperlihatkan dua sifat marker vektor, maka dapat dipastikan bahwa kemungkinan kedualah yang terjadi. Selanjutnya, untuk membedakan antara kemungkinan kedua dan ketiga dilihat pula perubahan sifat yang terjadi pada sel inang. Jika sel inang hanya memperlihatkan salah satu sifat di antara kedua marker vektor, maka dapat dipastikan bahwa kemungkinan ketigalah yang terjadi.

Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe), yang pembuatannya dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase chain reaction (PCR). Penjelasan lebih rinci tentang teknik PCR. Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan melalui cara yang dinamakan hibridisasi koloni. Koloni-koloni sel rekombinan ditransfer ke membran nilon, dilisis agar isi selnya keluar, dibersihkan protein dan remukan sel lainnya hingga tinggal tersisa DNAnya saja. Selanjutnya, dilakukan fiksasi DNA dan perendaman di dalam larutan pelacak. Posisi-posisi DNA yang terhibridisasi oleh fragmen pelacak dicocokkan dengan posisi koloni pada kultur awal (master plate). Dengan demikian, kita bisa menentukan koloni-koloni sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan.

Susunan materi genetik diubah dengan jalan menyisipkan gen baru yang unggul ke dalam kromosomnya.Tanaman transgenik memiliki kualitas lebih dibanding tanaman konvensional, kandungan nutrisi lebih tinggi, tahan hama, tahan cuaca, umur pendek, dll; sehingga penanaman komoditas tersebut dapat memenuhi kebutuhan pangan secara cepat dan menghemat devisa akibat penghematan pemakaian pestisida atau bahan kimia lain serta tanaman transgenik produksi lebih baik

Teknik rekayasa genetika sama dengan pemuliaan tanaman; yaitu memperbaiki sifat-sifat tanaman dengan menambah sifat-sifat ketahanan terhadap cekaman hama maupun lingkungan yang kurang menguntungkan; sehingga tanaman transgenik memiliki kualitas lebih baik dari tanaman konvensional, serta bukan hal baru karena sudah lama dilakukan tetapi tidak disadari oleh masyarakat.

                   

 

gambar 1. proses transgenik pada tanaman

 

Teknik Isolasi Bakteri

Dalam mempelajari mikrobia tidak bisa dilakukan secara kasat mata. Sedangkan dalam suatu lokasi yang menurut manusia sudah cukup kecil, disana masih terdapat bakteri dalam jumlah besar dan juga bermacam-macam jenisnya. Selain itu, di alam  mikrobia pada umumnya tidak hidup tersendiri sebagai individu tunggal dan terlepas dari spesies yang lain. Mikrobia lebih sering ditemukan dalam bentuk koloni dan bersama-sama dengan mikrobia yang lain(Seiler, 2000). Oleh karena itu, dalam mempelajarinya, bakteri harus diambil dari alam lalu diisolasikan dalam suatu biakan murni. Biakan murni adalah biakan yang hanya berisi 1 jenis bakteri(Pelczar et al.,1988).

Ada berbagai cara untuk mengisolasi bakteri dalam biakan murni yaitu, cara pengenceran, cara penuangan, cara penggesekan atau penggoresan, cara penyebaran, cara pengucilan 1 sel, dan cara inokulasi pada hewan. Masing-masing mempunyai kelebihan dan kekurangan(Waluyo, 2007).

Untuk metode streak plate misalnya, mikrobia diletakkan dalam pada ujung plate menggunakan ose,lalu digoreskan pada permukaan medium agar tersebut dengan pola tertentu yang khas. Ada pula metode pour plate atau penuangan. Metode ini dapat digunakan untuk penghitungan bakteri secara langsung. Karena sebelum dituang bakteri tersebut diencerkan terlebih dahulu. Sehingga syarat penghitungan langsung yaitu dalam 1 media terdapat 30-300 koloni dapat terpenuhi(Prescott et.al.2008).

Metode pengenceran yaitu dengan mengencerkan misalnya 1 ose bakteri dengan air. Lalu hasil pengenceran tersebut diencerkan lagi dengan beberapa ketentuan. Hal ini bertujuan untuk mengurangi konsentrasi bakteri(Barazandeh,2008).  
III.                METODE

A.    Alat dan Bahan

1.      Alat

a.       Ose.

b.      Inkubator.

c.       Cawan petri steril.

d.      Bunsen.

e.       Korek.

2.      Bahan

a.       Nutrien agar tegak dan nutrien agar miring.

b.      Suspensi bahan yang mengandung bakteri atau campuran biakan bakteri.

B.     Cara Kerja

1.      Cara Goresan (Streak Plate Method)

a.       Cairkan nutrien agar dalam penangas air.

b.      Dinginkan sampai temperatur ± 50°.

c.       Tuangkan medium agar tersebut ke dalam cawan petri steril secara aseptik dan biarkan sampai dingin dan padat.

d.      Ambil 1 ose suspensi bahan  yang mengandung bakteri atau campuran bakteri secara aseptik, kemudian dibuat goresan pada  permukaan agar.

e.       Cawan petri diberi label (etiket) kemudian dibungkus dan dibalik untuk mencegah terjadinya tetesan air pada permukaan agar dari hasil kondensasi uap air.

f.       Sesudah inkubasi akan terlihat kolni pada bekas goresan. Pada permulaan goresan akan terjadi pertumbuhan yang lebat setelah diinkubasikan, sehingga akan sukar diisolasi. Tiao koloni yang terpisah mungkin berasal dari 1 macam sel bakteri.

g.      Salah satu koloni dipilih dari masing-masing tipe koloni yang tumbuh.

h.      Diambil secara aseptis dengan ose satu koloni yang dikehendaki dan suspensikan dalam air steril.

i.        Diperiksa dengan pengecatan Gram.

j.        Dipindahkan masing-masing jenis hasil isolasi ke dalam medium nutrien  agar miring.

k.      Diinkubasikan pada temperatur yang sesuai selama 24-28 jam.

l.        Uji kembali kemurniaanya dengan pengecatan Gram.

m.    Jika tiap tabung hanya terdapat satu macam bakteri berarti isolasi tersebut telah berhasil.

2.      Cara Taburan (Pour Plate Method)

a.       Bahan yang mengandung bakteri atau campuran seencer mungkin disuspensikan untuk      mendapatkan koloni yang terpisah-pisah sehingga mudah diisolasi.

b.      Medium untuk pertumbuhan bakteri (nutrien agar) dicairkan dalam penangas air (100°C), dinginkan sampai temperatur 50°C, kemudian diinokulasikan dengan satu ose suspensi secara aseptis. Digojog supaya tercampur rata.

c.       Dituangkan ke dalam cawan petri steril berlabel secara aseptis.

d.      Cawan-cawan petri tersebut dan selanjutnya diinkubasi pada temperatur kamar.

e.       Setelah 24-48 jam inkubasi, amati bentuk koloni bakteri baikyang tumbuh di permukaan dan di dalam agar, apakah koloni-koloni bakteri terpisah merata atau masih menyatu dengan bakteri lain membentuk spreader.

f.       Diperhatikan koloni yang tumbuh pada media baik yang ada di permukaan, tengah, dan dasar medium. Lalu dicatat semua koloni berdasarkan warna, bentuk, ukuran, dan konsistensi koloni.

3.      Surface Plate Method

a.       Cairkan nutrien agar dalam penangas air.

b.      Dinginkan sampai temperatur ± 50°.

c.       Tuangkan medium agar tersebut ke dalam cawan petri steril secara aseptik dan biarkan sampai dingin dan padat.

d.      Bahan yang mengandung bakteri atau campuran seencer mungkin disuspensikan untuk mendapatkan koloni yang terpisah-pisah sehingga mudah diisolasi.

e.       Tuangkan bakteri yang sudah diencerkan kedalam cawan petri berisi medium agar yang sudah padat secukupnya. Ratakan dengan dry glasky yang sudah disterilkan dengan alkohol dan lampu bunsen.

f.       Cawan petri diberi label (etiket) kemudian dibungkus dan dibalik untuk mencegah terjadinya tetesan air pada permukaan agar dari hasil kondensasi uap air.

                       g.      Sesudah inkubasi akan terlihat koloni pada permukaannya